Dye-Binding Assays for Evaluation of the Effects of Small Molecule Inhibitors

Abstract

 

 

Dye-binding assays, such as those utilizing Congo red and thioflavin T, are among the most widely used tools to probe the aggregation of amyloidogenic biomolecules and for the evaluation of small molecule inhibitors of amyloid aggregation and fibrillization.

 

A number of recent reports have indicated that these dye-binding assays could be prone to false positive effects when assessing inhibitors’ potential toward Aβ peptides, species involved in Alzheimer’s disease.

 

Specifically, this review focuses on the application of thioflavin T for determining the efficiency of small molecule inhibitors of Aβ aggregation and addresses potential reasons that might be associated with the false positive effects in an effort to increase reliability of dye-binding assays.

Keywords:

Alzheimer’s disease; amyloid peptide; small molecule inhibitor; dye-binding assay; thioflavin T; fluorescence

View: ACS ActiveView PDF | PDF | PDF w/ Links | Full Text HTML

Citing Articles

View all 10 citing articles
Citation data is made available by participants in CrossRef's Cited-by Linking service. For a more comprehensive list of citations to this article, users are encouraged to perform a search in SciFinder.
This article has been cited by 4 ACS Journal articles (4 most recent appear below).

• 

  4,4′-Diarylsulfanyl-2,2′,5,5′-tetraoxybiaryl Derivatives as a Water-Soluble Fluorescent Dye

  Akio Kamimura, Tomomi Nokubi, Ryusuke Watanabe, Mari Ishikawa, Kotaro Nasu, Hidemitsu Uno, and Michinori Sumimoto
  The Journal of Organic Chemistry2014 79 (3), 1068-1083

  • 4,4′-Diarylsulfanyl-2,2′,5,5′-tetraoxybiaryl Derivatives as a Water-Soluble Fluorescent Dye

    AkioKamimura, TomomiNokubi, RyusukeWatanabe, MariIshikawa, KotaroNasu, HidemitsuUno, and MichinoriSumimoto
    The Journal of Organic Chemistry2014 79 (3), 1068-1083
    4,4′-Disulfanyl-2,2′,5,5′-tetrahydrobiaryl (5,5′-disulfanyl hydroquinone dimer) derivatives were readily synthesized from benzoquinone and thiols via an oxidative coupling reaction. The hydroquinone dimers showed strong fluorescence upon excitation at 330 ...
    
    Abstract | Full Text HTML | PDF | PDF w/ Links
• 

  Tanshinones Inhibit Amyloid Aggregation by Amyloid-β Peptide, Disaggregate Amyloid Fibrils, and Protect Cultured Cells

  Qiuming Wang, Xiang Yu, Kunal Patal, Rundong Hu, Steven Chuang, Ge Zhang, and Jie Zheng
  ACS Chemical Neuroscience2013 4 (6), 1004-1015

  • Tanshinones Inhibit Amyloid Aggregation by Amyloid-β Peptide, Disaggregate Amyloid Fibrils, and Protect Cultured Cells

    QiumingWang, XiangYu, KunalPatal, RundongHu, StevenChuang, GeZhang, and JieZheng
    ACS Chemical Neuroscience2013 4 (6), 1004-1015
    The misfolding and aggregation of amyloid-β (Aβ) peptides into amyloid fibrils is regarded as one of the causative events in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). Tanshinones extracted from Chinese herb Danshen (Salvia Miltiorrhiza Bunge) were ...
    
    Abstract | Full Text HTML | PDF | PDF w/ Links
• 

  Cellular Polyamines Promote Amyloid-Beta (Aβ) Peptide Fibrillation and Modulate the Aggregation Pathways

  Jinghui Luo, Chien-Hung Yu, Huixin Yu, Rok Borstnar, Shina C. L. Kamerlin, Astrid Gräslund, Jan Pieter Abrahams, and Sebastian K. T. S. Wärmländer
  ACS Chemical Neuroscience2013 4 (3), 454-462

  • Cellular Polyamines Promote Amyloid-Beta (Aβ) Peptide Fibrillation and Modulate the Aggregation Pathways

    JinghuiLuo, Chien-HungYu, HuixinYu, RokBorstnar, Shina C. L.Kamerlin, AstridGräslund, Jan PieterAbrahams, and Sebastian K. T. S.Wärmländer
    ACS Chemical Neuroscience2013 4 (3), 454-462
    The cellular polyamines spermine, spermidine, and their metabolic precursor putrescine, have long been associated with cell-growth, tumor-related gene regulations, and Alzheimer’s disease. Here, we show by in vitro spectroscopy and AFM imaging, that these ...
    
    Abstract | Full Text HTML | PDF | PDF w/ Links
• 

  Facile Methodology for Monitoring Amyloid-β Fibrillization

  Nathan P. Cook and Angel A. Martí
  ACS Chemical Neuroscience2012 3 (11), 896-899

Tanshinones Inhibit Amyloid Aggregation by Amyloid-β Peptide, Disaggregate Amyloid Fibrils, and Protect Cultured Cells

Tanshinones Inhibit Amyloid Aggregation by Amyloid-β Peptide, Disaggregate Amyloid Fibrils, and Protect Cultured Cells

Abstract

 

The misfolding and aggregation of amyloid-β (Aβ) peptides into amyloid fibrils is regarded as one of the causative events in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD).

 

 

Tanshinones extracted from Chinese herb Danshen (Salvia Miltiorrhiza Bunge) were traditionally used as anti-inflammation and cerebrovascular drugs due to their antioxidation and antiacetylcholinesterase effects.

 

 

A number of studies have suggested that tanshinones could protect neuronal cells. In this work, we examine the inhibitory activity of tanshinone I (TS1) and tanshinone IIA (TS2), the two major components in the Danshen herb, on the aggregation and toxicity of Aβ1–42 using atomic force microscopy (AFM), thioflavin-T (ThT) fluorescence assay, cell viability assay, and molecular dynamics (MD) simulations. AFM and ThT results show that both TS1 and TS2 exhibit different inhibitory abilities to prevent unseeded amyloid fibril formation and to disaggregate preformed amyloid fibrils, in which TS1 shows better inhibitory potency than TS2.

 

 

Live/dead assay further confirms that introduction of a very small amount of tanshinones enables protection of cultured SH-SY5Y cells against Aβ-induced cell toxicity. Comparative MD simulation results reveal a general tanshinone binding mode to prevent Aβ peptide association, showing that both TS1 and TS2 preferentially bind to a hydrophobic β-sheet groove formed by the C-terminal residues of I31-M35 and M35-V39 and several aromatic residues.

 

 

Meanwhile, the differences in binding distribution, residues, sites, population, and affinity between TS1-Aβ and TS2-Aβ systems also interpret different inhibitory effects on Aβ aggregation as observed by in vitro experiments. More importantly, due to nonspecific binding mode of tanshinones, it is expected that tanshinones would have a general inhibitory efficacy of a wide range of amyloid peptides. These findings suggest that tanshinones, particularly TS1 compound, offer promising lead compounds with dual protective role in anti-inflammation and antiaggregation for further development of Aβ inhibitors to prevent and disaggregate amyloid formation.

タクリンと ドネペジルの話。

タクリンからドネペジルへの道

 

背景(過去）：　タクリンは1931年（戦前）に、抗菌作用を目的として合成された。その後、タクリンは1986年（戦後40年）に、中枢疾患治療薬としての臨床試験結果が報告され、1993年に至り、FDAはタクリンをAD治療薬として世界で始めて承認した。

しかし、肝機能障害のため現在は使用されていない。

 

タクリンの承認から3年後、1996年にFDAはドネペジル（アリセプト）を 新たなAD治療薬として承認した。

ドネペジルは従来から知られていた化合物ではなく、新規な構造を有する 世界初のAchエステラーゼ阻害剤＝分子標的薬である。

 

●シード物語：　ドネペジルは分子標的薬の開発を理解するには格好のテキストである。

ドネペジル開発の端緒になったシード化合物（１）は


偶然にも、薬理担当者からの アドバイスによって発見された。即ち、シード化合物は、別のPJで合成されたものだが、ラットにおいて　縮瞳、流涙などのAch作用が認められていた。

 

シード化合物(1)の誘導体を約100種類ほど合成すると、Ach阻害作用が70倍も強くなった化合物が見出された。

しかし、インビトロで高活性であったものの、
インビボではでは、作用が認められなかった。

 

●リード物語（その１）：　

ここで、評価系の酵素をウナギからラット由来の酵素に変えたところ、明らかにAch阻害作用は低く、1/40ぐらいの値だった。

そこで、ラットを使ったインビトロ系で、3年間に700程度の化合物が合成され、

その中から、最強のAch阻害剤（２）を見出すことができた。

リード化合物（２）は初めのシード化合物（１）と比べ、2万倍以上強い阻害活性を示したが、大きな問題点が見つかった。

 

●リード物語（その２）：　リード化合物（２）の問題点が臨床試験（治験）直前に明らかになった。

 

２は、生体利用率（BA）が２％と極めて悪く、98％が肝臓で分解されてしまうか、または吸収されないで、排泄される運命にあった。

テーマは臨床研究担当者から猛反対され、終結した。

 

◎ドネペジルへの展開：　阻害活性の向上は多くの化合物を合成することで、デザインできたが、BAの改善はなかなか予想が付かないものだった。薬物代謝（動態）の観点から見ると、アミドN-メチル基の脱メチル化が主たる代謝経路である。この点から、脱メチル化反応の起こらない、環状構造をした化合物のデザインが、突破口になった。

二環性化芳香環化合物を合成すると、そのBAも満足できるものになった。　そして最後のさいごに、インダノン骨格へとたどり着いたのである。

 

◎  ドネペジルはインダノン骨格を持ち、ベンジルピペリジン基を導入することで、満足するBAが得られた完成品である。

　

イヌのBAは60％、ヒトのBAは40％と改善され、ヒトにおける血中濃度の半減期は70時間を越えるものであって、このことが、ドネペジルの臨床試験で、一日一回投与を可能にした。

 

薬学愛論その２

☆　Ｆａｃｅ　Ｂｏｏｋ　に書いた旧友への 薬学・ナウ。


ボクは高校の時は、1年から３年まで一番勉強したのは生物。
ＮＨＫテキストも集めた。化学は　試験のためだけの勉強だったし、化学でメシを食おうとは思わなかった！ボクが薬学に入った７０年代は、薬学の生物系は、フォーカスが定まっていなかった。おまけに、薬学4年の時に、微生物の教室に入ることも考えたが、教室配属で女性陣のスクラムが強く、ハジキ飛ばされて合成系へと進んだので、薬品合成化学が修士までの専門になった。後は帝京大でズルズルと　製造化学をやり、大塚では　医薬生産部に属したが、圧倒的に面白かったのは　大塚製薬・医薬生産部での仕事、三度のメシより面白かったし、カラオケも格段にうまくなったよ。

31分前 · いいね！

 

 

高崎にきてから、薬物代謝、動態の大先輩に出会ったので　

なんとか薬を教えられるようになった。

6年制薬学は化学の上に、薬理学や病理学という臨床的な　花　が咲くようになった。もはや　創薬研究は薬学部ではできない。薬剤師養成という名の　おもてなし教育が主流となった。

この辺の6年制薬学・ナウ　という憂うべき現状について　原稿を作っています。薬剤師という資格と、メシの種を求めて、医学部と同じお金をつぎ込むようなご時世だから、テンションの高い学生は、医学部へ流れていく。濁流の中の６年制薬学だな。教員も、私の周りに限れば、『薬学部が良くなった『という人は、きわめて少ない。

19分前 · いいね！

 

 

おまけに、スマホ学習の横行がある。おととし薬学7年生（一期生）のリクエストで薬学ブログを始めた。看護学部の授業では、終りの30分だけ、スマホ解禁にして　自習という名の　まとめ　を行っている。講義はどこでも、ＰＰＴ、おまけに　ＰＰＴを配布資料にしている。これをやると、城報収集力とそれと一番重要な、テイスト即ち、情報選別力がつかない。

誰かの意見や考えに　イイネ　しいているだけだ。　イイネじゃないね！という力量がないと、医療人としては　不十分だ。医師や看護師に　イイネ　するだけの薬剤師はイラナイ。

マリアアザミ

Ortho Directed Metallation for Indole Synthesis

6-Azaindoles from aminopyridines

Epigenetic Regulator I-BET762

Benzodiazepine & Benzoxazepine Inhibitors: 2013 JMC

Selective DDR1 Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor

We identified a mutation in the hinge region of DDR1, G707A, that confers >20-fold resistance to the ability of DDR1-IN-1 to inhibit DDR1 autophosphorylation and can be used to establish what pharmacology is DDR1-dependent.


A combinatorial screen of DDR1-IN-1 with a library of annotated kinase inhibitors revealed that inhibitors of PI3K and mTOR such as GSK2126458 potentiate the antiproliferative activity of DDR1-IN-1 in colorectal cancer cell lines.



DDR1-IN-1 provides a useful pharmacological probe for DDR1-dependent signal transduction.

Dinaciclib Interacts with the Acetyl-Lysine Recognition Site of Bromodomains

 

https://en.wikipedia.org/wiki/Dinaciclib

Dinaciclib is a potent inhibitor of cyclin-dependent kinases (CDKs), which recently advanced to Phase III clinical trials for the treatment of leukemia.



We determined the crystal structure of dinaciclib in complex with CDK2 at 1.7 Å resolution, revealing an elaborate network of binding interactions in the ATP site, which explains the extraordinary potency and selectivity of this inhibitor.


Remarkably, dinaciclib also interacted with the acetyl-lysine recognition site of the bromodomain testis-specific protein BRDT, a member of the BET family of bromodomains.


The binding mode of dinaciclib to BRDT at 2.0 Å resolution suggests that general kinase inhibitors (“hinge binders”) possess a previously unrecognized potential to act as protein–protein inhibitors of bromodomains.


The findings may provide a new structural framework for the design of next-generation bromodomain inhibitors using the vast chemical space of kinase inhibitors.

Tau Aggregation Inhibitors

Agents capable of preventing the misfolding and sequestration of the microtubule-stabilizing protein tau into insoluble fibrillar aggregates hold considerable promise for the prevention and/or treatment of neurodegenerative tauopathies such as Alzheimer’s disease.

 

 

Because tauopathies are characterized by amyloidosis that is restricted to the central nervous system (CNS), plausible candidate compounds for in vivo evaluation must both prevent tau fibrillization and achieve significant brain levels.

 

 

Recently, we reported the discovery of the aminothienopyridazine (ATPZ) class of tau aggregation inhibitors

 

and now describe a series of new analogues that are both effective inhibitors of tau fibrillization and display significant brain-to-plasma exposure ratios after administration to mice.

 

 

 

Further, two of the most promising examples, 15 and 16, were found to reach significant brain exposure levels following oral administration. Taken together, these results suggest that examples from the ATPZ class hold promise as candidates for in vivo efficacy studies in animal models of neurodegenerative tauopathies.

Tau Complex Inhibition by Prototype Inhibitors

Kinetic Studies of Cdk5/p25 Kinase:

Phosphorylation of Tau and Complex Inhibition by Two Prototype Inhibitors








These studies served as a necessary kinetic backdrop for investigations of the mechanism of inhibition by prototype inhibitors :

N4-(6-aminopyrimidin-4-yl)-sulfanilamide (APS) and 1-(5-cyclobutyl-thiazol-2-yl)-3-isoquinolin-5-yl-urea (CTIU).


We found that the cdk5/p25-catalyzed phosphorylation of tau follows a rapid equilibrium, random kinetic mechanism, as evidenced by initial velocity analysis indicating sequential addition of tau and ATP, and studies of the mechanism of inhibition by substrate analogue AMP, product ADP, and analogues of peptide substrate H1P. Identical mechanistic conclusions were drawn when H1P was the phosphoryl acceptor.



Subsequent studies of inhibition by APS and CTIU revealed that
both compounds can bind to all four steady-state forms of the enzyme,
to form the complexes E:I, E:I:tau, E:I:ATP, and E:I:tau:ATP.



These results contrast with reported claims that APS and CTIU are competitive inhibitors of the binding of ATP.

Type II Kinase Inhibitors

 

 

 

A number of well-known type II inhibitors (ATP-noncompetitive) that bind kinases in their DFG-out conformation were tested against wild-type LRRK2 and the most common Parkinson’s disease-linked mutation, G2019S.

 

 

We found that traditional type II inhibitors exhibit surprising variability in their inhibition mechanism between the wild type (WT) and the G2019S mutant of LRRK2.

 

 

The type II kinase inhibitors were found to work in an ATP-competitive fashion against the G2019S mutant, whereas they appear to follow the expected noncompetitive mechanism against WT.

 

 

 

Because the G2019S mutation lies in the DXG motif (DYG in LRRK2 but DFG in most other kinases) of the activation loop, we explored the structural consequence of the mutation on loop dynamics using an enhanced sampling method called metadynamics.

 

 

 

The simulations suggest that the G2019S mutation stabilizes the DYG-in state of LRRK2 through a series of hydrogen bonds, leading to an increase in the conformational barrier between the active and inactive forms of the enzyme and a relative stabilization of the active form.

 

 

The conformational bias toward the active form of LRRK2 mutants has two primary consequences. (1)

 

 

 

The mutant enzyme becomes hyperactive, a known contributor to the Parkinsonian phenotype, as a consequence of being “locked” into the activated state, and (2) the mutation creates an unusual allosteric pocket that can bind type II inhibitors but in an ATP-competitive fashion.

 

 

 

Our results thus suggest that developing type II inhibitors, which are generally considered superior to type I inhibitors because of desirable selectivity profiles, might be especially challenging for the G2019S LRRK2 mutant.

 

 

 

学会の要旨（２）

ピペラジン導入反応（Ｃ－ピペラジニル化反応） の検討と展開（２）

 

(序）　トップドラッグ（１）は高度完成型の医薬品であるが、プロセス研究の観点から見ると、さらなる創薬展開の起点にもなりうる。（２）日本で造られたトップドラッグに関する近刊書の中から、代表手的な日本製品を選び出すと、エビリファイ、イリノテカン、ピタバスタチン、クレストール、アリセプトなどがある。

 

一方、現在最先端で開発中のものに目を転じても、類似構造の開発品があることに気づく。端的な例を挙げると、Voritoxetine, JTC-801, Lenvatinib　等が、活性の面からも注目に値するものである。即ち安直且つ安全な創薬研究は、トップドラッグとトップドラッグ候補の中にシーズフラグメントを求めるべき時である。

　

本稿の主題となるエビリファイやオランザピン、クエチアピン、ルラシドンの重要フラグメント構造（メッセージ構造）はアリールピペラジン環である。筆者らはエビリファイの開発が本格化した2000年ころよりアリールピペラジン構造のプロセス研究を始め、その研究成果の一端は既に報告済である。多様なアリールピペラジン環の製造法についても、反応と合成のシンポジウム（回2011年徳島）にて報告した。即ち、古典的工業製法から、最近の金属触媒アミノ化反応まで各種（約6種程度）の合成法が適用可能である。しかし、それぞれに固有の問題点も顕在し、今日的見地からの簡便かつ安全な新合成法の開発はジェネリック生産を含む関連製薬企業にとっての戦略的急務となっている。

 

（１．Ｃ－ピペラジニル化反応）
Pd触媒によるBHアミノ化反応はハロベンゼンからのアリールピペラジン合成に有用であることが示されている。我々も既に、ポリハロベンゼンでの選択的なモノピペラジニル化反応について検討し、若干の問題点を指摘した。例えば、ポリハロ体のPd触媒アミノ化反応では、共存するハロゲン種の為、加熱反応下に複雑な生成物（夾雑物）を与えた。そのような傾向は特に、3連続置換型ハロベンゼンにおいて顕著であるが、立体的な因子からの制御条件も見出している。

　一方Wynbergアミノ化反応はメトキシ基を脱離基とする無触媒、塩基性ピペラジニル化（C-ピペラジニル化）反応である。興味深い点は、Wynbergアミノ化反応では、ハロゲン脱離基よりも、メトキシ基の方が優先的に反応するという点である。Wynbergアミノ化反応の特徴を以下に図示する。

　

　今回、Wynbergアミノ化反応の展開として、ジプラシドン、ペロスピロン、ルラシドン の含まれる含硫アリールピペラジンフラグメントの新合成法開発について報告する。合成コンセプトの主眼は、古典的試薬（中間体）を用いない、既存の鍵中間体からの新規なアリールピペラジン合成法の開拓である。


（２．　新合成法の検討）
新合成法開拓のスキームを下図に示した。その骨子は、以下の点に要約される。


１．開示特許中の重要中間体アミドを出発原料とする。
２．アミドをイミノエーテルへと変換する（安全な合成中間体）
３．イミノエーテル型　Wynbergアミノ化反応条件の探索。
４．アミドからの直接的カルボニル＝ピペラジニル化の探索。
５．アミドからフッ物への変換反応の検討。




 

看護師を薬剤師レベルにする本（２）

◆　薬剤師レベル　の知識を習得するための本

http://www.tkd-pbl.com/author/a49119.html



学習の基本レベルを知ること：
くすりの学習は　英語の学習と　同じです。

英語ができない人は　

断片的な スピ～ド学習しか　しないということです。

 

 英語ができない人は　

おおむね　日本語の語彙不足　が目立ちます。　

 

 要するに　新しい知識や　言葉を

古い知識や　言葉と一緒に　整理することができないのです。

 

逆に、英語ができる人は

＜現代医療用語＞も　簡単に　頭に入り、

整理ができることと　思いますので、

 ＜基本レベルのくすりの知識＞は　誰でも到達可能なのです。

http://www.tkd-pbl.com/author/a49119.html