癌代謝静止効果を有するジェネリック薬とその活用

たとえば

http://www.google.co.jp/patents/WO2010044404A1?cl=ja

縮合複素環誘導体及びその医薬用途
WO 2010044404 A1

要約書

血漿尿酸値異常に起因する疾患等の予防又は治療薬として有用な化合物を提供する。 本発明は、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有し、血漿尿酸値異常に起因する疾患の予防又は治療薬として有用な、下記式（Ｉ）で表される縮合複素環誘導体、そのプロドラッグ、又はその塩等に関する。式（Ｉ）中、Ｔはトリフルオロメチル、ニトロ又はシアノ；環Ｑはヘテロアリール；Ｘ^１及びＸ^２は独立してＣＨ又はＮ；環Ｕはアリール又はヘテロアリール；ｍは０～２の整数；ｎは０～３の整数；Ｒ^１は水酸基、アミノ又はＣ_１－６アルキル；Ｒ^２は、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル等である。

特許請求の範囲(21)

1. 式
   

   

   〔式中、
   Ｔはトリフルオロメチル、ニトロ又はシアノ；
   環Ｑは５又は６員環ヘテロアリール；
   Ｘ^１及びＸ^２は独立して、ＣＨ又はＮ；
   環ＵはＣ_６アリール又は５又は６員環ヘテロアリール；
   ｍは０～２の整数；
   ｎは０～３の整数；
   Ｒ^１は水酸基、ハロゲン原子、アミノ又はＣ_１－６アルキル（ｍが２であるとき、２つのＲ^１は異なっていてもよい）；
   Ｒ^２は、
   （ｉ）環Ｑ内の炭素原子に結合している場合は、（１）～（１１）：
   　（１）ハロゲン原子；
   　（２）水酸基；
   　（３）シアノ；
   　（４）ニトロ；
   　（５）カルボキシ；
   　（６）カルバモイル；
   　（７）アミノ；
   　（８）それぞれ独立して、置換基群αから選択される任意の基を有していてもよいＣ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル又はＣ_１－６アルコキシ；
   　（９）Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ_１－６アルキルスルホニル、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルスルファモイル、Ｃ_２－７アシル、Ｃ_１－６アルコキシカルボニル、Ｃ_１－６アルコキシカルボニルオキシ、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルアミノ、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキルアミノ、Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル（Ｃ_１－６アルキル）アミノ、Ｃ_２－７アシルアミノ、Ｃ_１－６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_１－６アルコキシカルボニル（Ｃ_１－６アルキル）アミノ、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルカルバモイル、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキルカルバモイル、Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル（Ｃ_１－６アルキル）カルバモイル、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルアミノカルボニルアミノ、Ｃ_１－６アルキルスルホニルアミノ又はＣ_１－６アルキルチオ；
   　（１０）Ｃ_３－８シクロアルキル、３～８員環ヘテロシクロアルキル、Ｃ_５－８シクロアルケニル又は５～８員環ヘテロシクロアルケニル；
   　（１１）Ｃ_６アリール、Ｃ_６アリールオキシ、Ｃ_６アリールカルボニル、５又は６員環ヘテロアリール、５又は６員環ヘテロアリールオキシ、５又は６員環ヘテロアリールカルボニル、Ｃ_６アリールアミノ、Ｃ_６アリール（Ｃ_１－６アルキル）アミノ、５又は６員環ヘテロアリールアミノ又は５又は６員環ヘテロアリール（Ｃ_１－６アルキル）アミノ；の何れかであり、
   （ｉｉ）　環Ｑの窒素原子に結合している場合は、（１２）～（１５）：
   　（１２）それぞれ独立して、置換基群αから選択される任意の基を有していてもよいＣ_１－６アルキル又はＣ_２－６アルケニル；
   　（１３）Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ_１－６アルキルスルホニル、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルスルファモイル、Ｃ_２－７アシル、Ｃ_１－６アルコキシカルボニル又はモノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルカルバモイル；
   　（１４）Ｃ_３－８シクロアルキル又は３～８員環ヘテロシクロアルキル；
   　（１５）Ｃ_６アリール、５又は６員環ヘテロアリール、Ｃ_６アリールカルボニル又は５又は６員環ヘテロアリールカルボニル；の何れかであり；
   （ｎが２又は３であるとき、Ｒ^２はそれぞれ異なっていてもよく、更に、２つのＲ^２が、環Ｑ内の隣り合った原子に結合して存在し、それぞれＣ_１－６アルコキシを有していてもよいＣ_１－６アルキルである場合は、結合する環Ｑ内の原子と共に、５～８員環を形成してもよい。）；
   　　　置換基群αは、フッ素原子、水酸基、アミノ、カルボキシ、Ｃ_１－６アルコキシ、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルアミノ、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキルアミノ、Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル（Ｃ_１－６アルキル）アミノ、Ｃ_１－６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_２－７アシル、Ｃ_１－６アルコキシカルボニル、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルカルバモイル、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキルカルバモイル、Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル（Ｃ_１－６アルキル）カルバモイル、Ｃ_１－６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ_２－７アシルアミノ、Ｃ_１－６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_３－８シクロアルキル、３～８員環ヘテロシクロアルキル、Ｃ_６アリール及び５又は６員環ヘテロアリールである〕で表される縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
2. Ｔがシアノである請求項１記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
3. Ｘ^１がＣＨである請求項１又は２記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
4. Ｘ^２がＣＨである請求項１～３の何れかに記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
5. 環Ｑがピリジン、ピリミジン、ピラジン、チアゾール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、チオフェン、フラン又はピロール環である請求項１～４の何れかに記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
6. 環Ｑがピリジン、チオフェン又はピロール環である請求項５記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
7. 環Ｕがベンゼン、ピリジン、チアゾール、ピラゾール又はチオフェン環である請求項１～６の何れかに記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
8. ｍが０であるか、又はｍが１であり、かつ、環Ｕが下記式：
   

   

   （式中、Ｒ^１aは水酸基；アミノ；又はＣ_１－６アルキルであり、Ａは縮合環との結合を、Ｂはカルボキシとの結合をそれぞれ表す）で表される何れかの環である、請求項７記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
   
9. ｍが０であるか、又はｍが１であり、かつＲ^１aが水酸基又はＣ_１－６アルキルである、請求項８記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
10. 環Ｕがチアゾール環である請求項８又は９記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
11. ｍが０であるか、又はｍが１；かつＲ^１aが水酸基であり、かつ環Ｕがピリジン環である請求項９記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
12. Ｒ^１aがメチルである、請求項１０記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
13. Ｒ^１aが水酸基である、請求項１１記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
14. ｎが０であるか、又はｎが１～３であり、かつＲ^２が環Ｑの炭素原子に結合するハロゲン原子；水酸基；それぞれフッ素原子、水酸基及びアミノから選択される任意の基を１～３個有していてもよいＣ_１－６アルキル又はＣ_１－６アルコキシ；Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル；もしくはＣ_１－６アルコキシＣ_１－６アルコキシ；又は環Ｑの窒素原子に結合する、フッ素原子、水酸基及びアミノから選択される任意の基を１～３個有していてもよいＣ_１－６アルキル；もしくはＣ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキルである、請求項１～１３の何れかに記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
15. ｎが０であるか、又はｎが１～３であり、かつＲ^２が環Ｑの炭素原子に結合するハロゲン原子；水酸基；もしくはフッ素原子を１～３個有していてもよいＣ_１－６アルキル；又は環Ｑの窒素原子に結合する、フッ素原子を１～３個有していてもよいＣ_１－６アルキル；もしくはＣ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキルである、請求項１４記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
16. キサンチンオキシダーゼ阻害薬である、請求項１～１５の何れかに記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
17. 請求項１～１５の何れかに記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
18. 高尿酸血症、痛風結節、痛風関節炎、高尿酸血症による腎障害及び尿路結石から選択される疾患の予防又は治療用である、請求項１７記載の医薬組成物。
19. 高尿酸血症の予防又は治療用である、請求項１８記載の医薬組成物。
20. 血漿尿酸値低下薬である、請求項１７記載の医薬組成物。
21. 尿酸生成抑制薬である、請求項１７記載の医薬組成物。

明細書

縮合複素環誘導体及びその医薬用途 　本発明は、医薬品として有用な縮合複素環誘導体に関するものである。
　さらに詳しく述べれば、本発明は、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有し、血清尿酸値異常に起因する疾患の予防又は治療薬として有用な、縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ、又はその薬理学的に許容される塩に関するものである。 　尿酸はヒトにおける、プリン体代謝の最終産物である。多くの哺乳類では、ヒトと異なり、肝臓の尿酸酸化酵素（ウリカーゼ）により尿酸がさらにアラントインに分解され、腎臓より排泄される。ヒトにおける尿酸排泄の主な経路は腎臓であり、約２／３が尿中に排泄され、残りは糞便より排泄される。尿酸産生が過剰になったり、尿酸排泄が低下することにより高尿酸血症が起こる。高尿酸血症は、尿酸産生過剰型、尿酸排泄低下型及びその混合型に分類される。この高尿酸血症の分類は臨床上重要であり、治療薬の副作用軽減を考慮して、各分類における治療薬が選択されている（例えば、非特許文献１参照）。

縮合複素環誘導体及びその医薬用途
WO 2010044404 A1

 

 

 

要約書

 

 

血漿尿酸値異常に起因する疾患等の予防又は治療薬として有用な化合物を提供する。

 

 

本発明は、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有し、血漿尿酸値異常に起因する疾患の予防又は治療薬として有用な、下記式（Ｉ）で表される縮合複素環誘導体、そのプロドラッグ、又はその塩等に関する。式（Ｉ）中、Ｔはトリフルオロメチル、ニトロ又はシアノ；環Ｑはヘテロアリール；Ｘ^１及びＸ^２は独立してＣＨ又はＮ；環Ｕはアリール又はヘテロアリール；ｍは０～２の整数；ｎは０～３の整数；Ｒ^１は水酸基、アミノ又はＣ_１－６アルキル；Ｒ^２は、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル等である。

 

 

 

特許請求の範囲(21)

1. 式
   

   

   
   
2.  
3. 〔式中、Ｔはトリフルオロメチル、ニトロ又はシアノ；
   環Ｑは５又は６員環ヘテロアリール；Ｘ^１及びＸ^２は独立して、ＣＨ又はＮ；環ＵはＣ_６アリール又は５又は６員環ヘテロアリール；
   ｍは０～２の整数；
   ｎは０～３の整数；
   Ｒ^１は水酸基、ハロゲン原子、アミノ又はＣ_１－６アルキル（ｍが２であるとき、２つのＲ^１は異なっていてもよい）；
   Ｒ^２は、
   （ｉ）環Ｑ内の炭素原子に結合している場合は、（１）～（１１）：
   　（１）ハロゲン原子；
   　（２）水酸基；
   　（３）シアノ；
   　（４）ニトロ；
   　（５）カルボキシ；
   　（６）カルバモイル；
   　（７）アミノ；
   　（８）それぞれ独立して、置換基群αから選択される任意の基を有していてもよいＣ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル又はＣ_１－６アルコキシ；
   　（９）Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ_１－６アルキルスルホニル、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルスルファモイル、Ｃ_２－７アシル、Ｃ_１－６アルコキシカルボニル、Ｃ_１－６アルコキシカルボニルオキシ、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルアミノ、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキルアミノ、Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル（Ｃ_１－６アルキル）アミノ、Ｃ_２－７アシルアミノ、Ｃ_１－６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_１－６アルコキシカルボニル（Ｃ_１－６アルキル）アミノ、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルカルバモイル、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキルカルバモイル、Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル（Ｃ_１－６アルキル）カルバモイル、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルアミノカルボニルアミノ、Ｃ_１－６アルキルスルホニルアミノ又はＣ_１－６アルキルチオ；
   　（１０）Ｃ_３－８シクロアルキル、３～８員環ヘテロシクロアルキル、Ｃ_５－８シクロアルケニル又は５～８員環ヘテロシクロアルケニル；
   　（１１）Ｃ_６アリール、Ｃ_６アリールオキシ、Ｃ_６アリールカルボニル、５又は６員環ヘテロアリール、５又は６員環ヘテロアリールオキシ、５又は６員環ヘテロアリールカルボニル、Ｃ_６アリールアミノ、Ｃ_６アリール（Ｃ_１－６アルキル）アミノ、５又は６員環ヘテロアリールアミノ又は５又は６員環ヘテロアリール（Ｃ_１－６アルキル）アミノ；の何れかであり、
   （ｉｉ）　環Ｑの窒素原子に結合している場合は、（１２）～（１５）：
   　（１２）それぞれ独立して、置換基群αから選択される任意の基を有していてもよいＣ_１－６アルキル又はＣ_２－６アルケニル；
   　（１３）Ｃ_２－６アルキニル、Ｃ_１－６アルキルスルホニル、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルスルファモイル、Ｃ_２－７アシル、Ｃ_１－６アルコキシカルボニル又はモノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルカルバモイル；
   　（１４）Ｃ_３－８シクロアルキル又は３～８員環ヘテロシクロアルキル；
   　（１５）Ｃ_６アリール、５又は６員環ヘテロアリール、Ｃ_６アリールカルボニル又は５又は６員環ヘテロアリールカルボニル；の何れかであり；
   （ｎが２又は３であるとき、Ｒ^２はそれぞれ異なっていてもよく、更に、２つのＲ^２が、環Ｑ内の隣り合った原子に結合して存在し、それぞれＣ_１－６アルコキシを有していてもよいＣ_１－６アルキルである場合は、結合する環Ｑ内の原子と共に、５～８員環を形成してもよい。）；
   　　　置換基群αは、フッ素原子、水酸基、アミノ、カルボキシ、Ｃ_１－６アルコキシ、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルアミノ、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキルアミノ、Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル（Ｃ_１－６アルキル）アミノ、Ｃ_１－６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_２－７アシル、Ｃ_１－６アルコキシカルボニル、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルキルカルバモイル、モノ（ジ）Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキルカルバモイル、Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル（Ｃ_１－６アルキル）カルバモイル、Ｃ_１－６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ_２－７アシルアミノ、Ｃ_１－６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_３－８シクロアルキル、３～８員環ヘテロシクロアルキル、Ｃ_６アリール及び５又は６員環ヘテロアリールである〕で表される縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
4. Ｔがシアノである請求項１記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
5. Ｘ^１がＣＨである請求項１又は２記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
6. Ｘ^２がＣＨである請求項１～３の何れかに記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
7. 環Ｑがピリジン、ピリミジン、ピラジン、チアゾール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、チオフェン、フラン又はピロール環である請求項１～４の何れかに記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
8. 環Ｑがピリジン、チオフェン又はピロール環である請求項５記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。
9. 環Ｕがベンゼン、ピリジン、チアゾール、ピラゾール又はチオフェン環である請求項１～６の何れかに記載の縮合複素環誘導体もしくはそのプロドラッグ又はその薬理学的に許容される塩。

http://www.google.co.jp/patents/WO2010044404A1?cl=ja


 

Cilostazol As a Reagent involved in Rho Study 2013

IL-23 production was elevated by lipoteichoic acid (LTA), 
which increased the activation of RhoA in association with increased the nuclear translocation of NF-kB
and its DNA-binding activity.

Pretreatment of RA macrophages with the pharmacological inhibitors exoenzyme C3 (RhoA),
Y27632 (Rho-kinase) or BAY11-7082 (NF-kB)
inhibited IL-23 production by LTA.

Inhibition of the RhoA/Rho-kinase pathway by these drugs attenuated NF-kB activation.


Cilostazol suppressed the TLR2-mediated activation of RhoA,
decreased NF-kB activity with down-regulated IL-23 production, and these effects were reversed by RpcAMPS,
as an inhibitor of cAMP-dependent protein kinase.

 Abbreviations

• CIA, collagen induced arthritis;
• IL-23, interleukin-23;
• LTA, lipoteichoic acid;
• RA, rheumatoid arthritis;
• TLR2, toll like receptor 2

 Cilostazol suppressed the TLR2-mediated activation of RhoA, decreased NF-κB activity with down-regulated IL-23 production,

and these effects were reversed by Rp-cAMPS, as an inhibitor of cAMP-dependent protein kinase. The expression of IL-23, which colocalized with CD68(+) cells in knee joint of CIA mice, was significantly attenuated by cilostazol along with the decreased severity of arthritis.

Graphical abstract

Figure options

• Download full-size image
• Download as PowerPoint slide

Abbreviations

• CIA, collagen induced arthritis;
• IL-23, interleukin-23;
• LTA, lipoteichoic acid;
• RA, rheumatoid arthritis;
• TLR2, toll like receptor 2

 

 

Taken together, the RhoA/Rho-kinase pathway signals TLR2-stimulated IL-23 production in synovial fluid macrophages via activation of NF-κB.

Thus it is summarized that cilostazol suppresses TLR2-mediated IL-23 production by suppressing RhoA pathway via cAMP-dependent protein kinase activation.

http://www.sciencedirect.com.scopeesprx.elsevier.com/science/article/pii/S0167527314001703

2.1. Reagents and antibodies

Lipoteichoic acid (LTA),
BAY11-7082 and
Y27632, were obtained from Sigma (St. Louis, MO).


Rp-cAMPS was purchased
from Alexis (San Diego, CA).
Clostridium botulinum exoenzyme C3 transferase (exoenzyme C3) was from Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY. Anti-TLR2 antibody was from Abcam (Cambridge, MA).


NF-kB p65, IkBa, Histone H1and
RhoA antibodies were from Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).


TLR2 neutralizing antibody was from eBioscience (San Diego, CA). IgG isotype control antibody (R&D systems, Minneapolis, MN).


Cilostazol (OPC-13013),
[6-[4-(1-cyclohexyl-1H-tetrazol-5-yl)butoxy]-3,4-dihydro-2-(1H)-quinolinone, >98.5% purity by HPLC,
mean particle size, 14–28 (mean, 20) mm] was donated by Otsuka
Pharmaceutical Co. Ltd. (Tokushima, Japan),

and was dissolved in dimethyl sulfoxide to produce
a 10 mM stock solution.


https://www.blogger.com/blogger.g?blogID=4733967785175105509#editor/target=post;postID=2313110350264441265



Furthermore,

Cilostazol is a commercially available drug that has antiplatelet and vasodilatory activity and is indicated for peripheral artery disease (PAD)-related intermittent claudication [3].

 

 

We and other investigators have found that cilostazol may have beneficial effects on EPCs in vitro [3] and [4] and can provide vasculo-angiogenic effects in murine hindlimb ischemia [3] and [5].

 

 

Therefore, we hypothesized that cilostazol can enhance mobilization and proliferation of EPCs and collateral formation by modifying vasculo-angiogenic biomarkers in PAD.

 

 

 

This prospective, double-blind, randomized placebo-controlled trial consecutively enrolled 44 patients with mild-to-moderate PAD who had ankle-brachial index less than 0.9 in one or both legs without obvious intermittent claudication. Exclusion criteria were listed in the registered study protocol (Clinicaltrials.org registration number NCT01952756).

 

 

All study participants provided signed informed consent, and this study followed the regulation of the ethics committee of the National Cheng Kung University Hospital, where all data were collected.

Eligible subjects were randomly assigned to cilostazol 200 mg (n = 24) or dummy placebo (n = 20) daily for 12 weeks using unrestricted randomization and sealed envelopes for allocation concealment. Serum concentrations of biomarkers were measured by enzyme-linked immunosorbent assay [6].

 

 

The isolation of human early EPCs was performed according to standard protocols [3].

 

 

The quantification of colony formation by EPCs was performed and the chemotactic motility, proliferation/viability (XTT) and apoptosis of EPCs were measured as previously described [3].


http://www.sciencedirect.com.scopeesprx.elsevier.com/science/article/pii/S0167527314001703

thioflavin-T (ThT) fluorescence assay

2.5. Measurement of intracellular reactive oxygen species (ROS) formation

Free radical production was measured by incubating the cells
with the fluorescent probe 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate
(DCFH2-DA, Molecular Probe, USA). The DCFH2-DA dye, which is oxidized
to fluorescent 2′,7′-dichlorofluorescein (DCF) by hydroperoxide,
was used to measure the relative levels of cellular peroxides [34].


SH-SY5Y cells were pre-incubated in a 24-well culture plate (4×105
cells per well in 400 μL medium) for 24 h. Subsequently, cells were
rinsed by PBS, treated with each compound in serum-free medium,
and then incubated at 37 °C for 24 h.

After incubation, cells were treated with 400 μM H2O2 
for different times (5, 10, 15 and 20 min) and
then each well was rinsed with standard medium
(138 mM NaCl, 2.7 mMKCl, 1.2 mMCaCl2, 1.2 mMMgCl2, 10 mMPBS and 10 mMglucose, pH 7.4).

Following this, cells were further treated with 5 μM
DCFH2-DA for 30 min at 37 °C into standard medium. Cells were then
washed once with standard medium before measurement. Fluorescence
was measured at 485 nm excitation and 535 nm emission wavelengths
by aMicroplate Fluorescence Reader (SpectraMAX GEMINI EM,
Molecular Devices).


2.6. Thioflavin T fluorescence assay

Thioflavin T (ThT) fluorescence assay was performed with synthetic
Aβ1–42 (Bachem, Switzerland) as described previously [35].

The Aβ1–42 solution in PBS (50 mM NaH2PO4, 100 mM NaCl, 0.02%
NaN3) in a final concentration of 25 μM was incubated at 37 °C for
48 h to be aggregated in the presence or absence of each compound.


After incubation, a final concentration of 15 μM ThT was added to
each well containing the aggregated Aβ fibril, followed by additional
15 min of incubation at 37 °C.


ThT fluorescence was measured at 450 nm excitation and 490 nm emission wavelengths by a Microplate Fluorescence Reader
(SpectraMAX GEMINI EM, Molecular Devices).


Readings were normalized by the DMSO-only negative control and
the results were expressed as percentage of relative fluorescence to
the control. Tannic acid, previously shown to inhibit Aβ aggregation,
was used as a positive control [36].



2.7. Atomic force microscopy (AFM) measurements

The Aβ1–42 solution in PBS in a final concentration of 12.5 μM was
freshly prepared and aliquoted. Aβ1–42 peptides exist as monomers
when they are freshly prepared. Oligomerized Aβ1–42 was prepared
according to the method described in the cell viability assay. The fibril
form of Aβ1–42 was formed by incubation at 37 °C for 48 h. During the
oligomerization process, 20 μM of each compound was co-incubated
to check the ability of compounds in blocking Aβ1–42 oligomerization.
20 μL of each aliquot of monomer, oligomer, fibril Aβ1–42 sample solution
and oligomerized Aβ1–42 in the presence of each compound was
placed on the mica sheet (Structure Probe Inc., USA) and dried.

After this, the samples were scanned by AFM (XE-70, Park Systems, Korea),
and analyzed by XEI (Park Systems, Korea).


The reading scale of AFM micrograph was 4 μm×4 μm square,
composed of 256×256 pixels.
Each micrograph was measured with 256 maximum heights from
each horizontal line per pixel and average maximum heights were
obtained.

Oligomerization inhibition percentage was calculated from
the average maximum heights of oligomerized Aβ1–42 in the presence
of each compound vs oligomerized Aβ1–42 only.


2.8. Western blotting analysis
Cells and rat brain tissue were lysed by lysis buffer solution
containing 50 mMTris–HCl, 300 mMNaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol,
1.5 mM MgCl2, 1 mMCaCl2, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride
(PMSF) and 1% protease inhibitor cocktail.

Protein concentrations of soluble extracts in the lysates were determined
by BCATM Protein Assay Kit (Pierce, USA).


A total of 50 μg of protein was loaded per well.
Samples were run on 12% polyacrylamide gels and transferred to
polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes (Millipore Corporation,
USA). Membranes were blocked for 1 h at room temperature in
Tris-buffered saline with 0.1% Tween-20 (TBST) with 5% skim milk.
Membranes were incubated overnight at 4 °C with α-tubulin (1:1000
dilution, loading control), caspase-3 (1:1000), p35/25 (1:1000), MAPK
or p-MAPK (1:1000), tau or p-tau (1:1000) primary antibodies diluted
in TBST with 5% bovine serum albumin (BSA). Secondary antibodies
used were anti-mouse IgG horseradish peroxidase for tau and p-tau,
and anti-rabbit IgG horseradish peroxidase for α-tubulin, caspase-3,
MAPK, p-MAPK, and p35/25 antibodies. Secondary antibodies were
diluted (1:2000) in TBST with 5% skim milk. All antibodies were purchased
from Cell Signaling Technology Inc (USA). After 2 h of incubation
with secondary antibodies, membranes were washed three times
with TBST and then detected by ECL plus western blotting detection
reagent (Ab frontier, Korea). Western blot images were analyzed
using Multi-Gauge Software (Fuji photo film Co. Ltd., Japan).


2.9. μ-Calpain assay in cells
μ-Calpain assay in cells was performed as described previously [29].
In order to measure μ-calpain inhibitory activity of compounds in
SH-SY5Y and HEK293T cells, the human CAPN1 gene, which encodes
the μ-calpain catalytic subunit, was synthesized (Bioneer, Korea) [27].
The plasmid of CAPN1-encoding pcDNA3.1/His A was subcloned using
restriction sites EcoR V and Xho I, and was transfected into SH-SY5Y
and HEK293T cells using WelFect QTM Plus (Welgene, Korea). After
transfection for adequate times, cells were incubated with each compound
for 210 min in μ-calpain reaction buffer containing 0.1% Triton
X-100. The cleavage product of pep1 by μ-calpainwas measured in a kinetic
mode by a Microplate Fluorescence Reader (SpectraMAX GEMINI
EM, Molecular Devices) maintained at 37 °C. Fluorescence was measured
at 320 nm excitation and 420 nm emission wavelengths.
2.10. Immunocytochemistry